Итак, мы получили ионы. Поскольку это заряженные частицы, мы можем с помощью электрического поля вытянуть их из той области, где они образовались. Теперь, начинается второй этап масс- спектрометрического анализа - сортировка ионов по массам (точнее по отношению массы к заряду, или m/z), собственно то, что дало имя этому методу. Это происходит в той части масс-спектрометра, которая называется "масс-анализатором".

Двойная фокусировка

Все масс-анализаторы используют физические законы движения заряженных частиц. Исторически первым масс-анализатором, остающимся непревзойденным по своим характеристикам и сегодня, был магнит. Согласно физическим законам траектория заряженных частиц в магнитном поле искривляется, а радиус кривизны зависит от массы частиц. Именно это используется для анализа ионов по массам. Для того, чтобы увеличить разрешение, на пути ионов устанавливается еще и электростатический анализатор. Магнитные масс-спектрометры имеют высокое разрешение и могут использоваться со всеми видами ионизации.

Несмотря на значительные преимущества современных магнитных масс-анализаторов перед остальными (рекордная чувствительность, однозначность идентификации, большой рабочий диапазон масс, широкий линейный диапазон), они обладают двумя основными "недостатками" - эти приборы большие как по размерам, так и по стоимости. Там, где нельзя без них обойтись, им нет альтернативы (органический анализ с высоким разрешением, анализ изотопных соотношений, элементный анализ на предельной чувствительности), но в современном мире существуют тысячи аналитических применений масс-спектрометрии, для многих из них годятся приборы и меньшего калибра.

Квадруполь
Квадрупольная ионная ловушка

Дальнейшее развитие квадрупольных анализаторов привело к созданию "ионной ловушки". Одна пара стержней была закручена в кольцо, а вторая пара превратилась в шарообразные чашки. Теперь комбинация радиочастотных и постоянных напряжений, прикладываемых к электродам ионной ловушки, стала позволять удерживать ионы внутри нее или выбрасывать из нее. Первые ионные ловушки, выпущенные фирмой Finnigan в 1983 году, потеряли даже ионный источник. Ионизация молекул стала проводиться прямо внутри ловушки. Впоследствии, правда, от этого отказались, вновь вынеся место, где создаются ионы, за пределы ионной ловушки, что оказалось более выигрышным (иллюстрация). Во-первых, внешний по отношению к масс-анализатору, ионный источник гарантирует отсутствие самохимической ионизации, приводящей к искажению масс-спектров электронного удара, а во-вторых, делает прибор гораздо более универсальным - можно анализировать отрицательные ионы, образующиеся при диссоциативном захвате электронов, можно использовать классический прямой ввод и т.д.
Существенным моментом работы ионных ловушек является подбор времени, в течение которого ионы остаются захваченными в ловушке. С одной стороны, это время должно быть достаточно "бльшим" (речь идет о милисекундах) для того, чтобы можно было провести фрагментацию ионов, выбросить из ловушки ненужные, провести следующую фрагментацию ионов, которые уже один раз претерпели ее и другие манипуляции с ионами. С другой стороны, слишком длительное время, проведенное в ловушке может приводить к нежелательным ионно-ионным и ионно-молекулярным реакциям, которые могут привести к нежелательным изменениям ммасс-спектра, а также к образованию объемного заряда, препятствующего как можно более полному детектированию ионов умножителем. Для того, чтобы избежать всего этого, Thermo Scientific использует патентованную систему AGC (Automatic Gain Control), которая "следит" за количеством ионов в ловушке. Система делает очень короткий прескан, в течение которого она определяет популяцию ионов, а затем уже подстраивает время, в течение которого ионы остаются в ловушке и делает аналитическое сканирование. Те. если ионов мало - время, которое они проводят в ловушке - увеличивается, если много, соответственно, наоборот. Это ни в коей мере не уменьшает скорость сканирования, но значительно увеличивает информационную ценность анализа - позволяет избавляться от нежелательных реакций между ионами или молекулами, за счет увеличения времени получения полезного сигнала добиваться максимальной чувствительности.
Появление квадрупольных ловушек на базе линейных квадруполей также явилось существенным прорывом в технологии масс-спектрметрического анализа. Прежде всего, линейная квадрупольная ловушка характеризуется большей емкостью ионов, кроме того, в ней можно проводить больше манипуляций с ионами путем контролируемой фрагментации или отбора ионов и за меньшее время. Процессы, происходящие в линейной квадрупольной ионной ловушке описываются ниже, там где речь идет о гибридных приборах, включающих масс-спектрометры с Фурье- преобразованием сигнала. Thermo Fisher Scientific в настоящее время выпускает два типа приборов с анализаторами типа линейная квадрупольная ловушка - LTQ XL^® и LXQ^®, ознакомиться с ними более подробно можно по соотвествующим ссылкам. Отметим только, что прибор LTQ XL является самым чувствительным масс-спектрометром среди всех существующих в мире.
Масс-спектрометры на базе ионной ловушки с внутренним источником ионов в настоящее время продолжают выпускаться фирмой Varian, приобретшей лицензию на этот масс-спектрометрический детектор у Finnigan в 1991 году.

Использование ионных ловушек дало импульс к развитию систем тандемной масс-спектрометрии или МС/МС. МС/МС - это когда масс-анализаторы выстраивают последовательно друг за другом. Зачем это понадобилось? Предположим, мы имеем дело со сложной органической молекулой (например, биохимики почти всегда имеют дело с такими) и разбив ее на фрагменты, мы все равно не имеем достаточно инофрмации о ее структуре. Из разделенных в первом масс-анализаторе ионов можно выбрать те, которые представляют для нас интерес, каким-нибудь образом заставить их развалиться на более мелкие фрагменты и снова рассортировать то, что получилось, по массам. Это и делается во втором масс-анализаторе. В случае использования магнитных и квадрупольных масс-анализаторов это означает, что нам нужно выстроить их друг за другом в линию. А ведь те, кто занимается анализом сложных молекул, столкнулись с тем, что и двух и трех последовательных масс-анализаторов иногда не достаточно для того, чтобы расшифровать их структуру. Вот здесь-то ионная ловушка оказалась как нельзя кстати. Как мы уже говорили в ионной ловушке можно удерживать ионы, которые представляют интерес, а остальные "выбросить" из нее. Оставшиеся в ловушке ионы можно подвергнуть распаду (управляемой фрагментации), зарегистрировать их, оставить в ловушке те, которые представляют интерес, остальные выбросить, подвергнуть фрагментации, зарегистрировать и т.д. В приборе LCQ Fleet или в линейной квадрупольной ионной ловушке FINNIGAN LTQ XL так можно поступить 10 или 15 раз и таким образом мы имеем систему МС¹⁰, в хромато-масс-спектрометре POLARISQ - 5 раз (система МС⁵). Другой масс-спектрометр TSQ Quantum является "классической" МС/МС системой - два квадрупольных анализатора стоят последовательно друг за другом (между ними еще один, но это не масс-анализатор, а "камера соударений").
Важнейшим преимуществом тандемной масс-спектрометриии в ГХ/МС является так называемый целевой анализ. Многочисленные задачи, стоящие перед аналитикой, подразумевают определение конкретных органических соединений в образцах, причем, чем меньше уровень их определения, тем лучше (например, допинговый контроль, определение пестицидов и других загрязнителей пищевой продукции и окружающей среды, анализ диоксинов). При этом концентрации и, соответственно, сигналы этих целевых соединений много меньше чем других многочисленных соединений, находящихся в этом же образце. Эти сигналы не видны за "химическим шумом" или сигналом матрицы. Для того, чтобы добиться селективности, можно использовать высокое разрешение, но это и сложнее и дороже, можно использовать метод селективной регистрации ионов (SIM). Селективная регистрация ионов приводит к огромному выигрышу в чувствительности (все время, которое тратилось раньше на запись полного масс-спектра, теперь тратиться на запись одного или нескольких ионов) и селективности (регистрируется только один или несколько ионов, а остальные не видны), но при этом приносится в жертву достоверность. Если по полному спектру в сочетаниии с хроматографическим временем удерживания можно было практически однозначно подтвердить целевое соединение, то теперь у нас осталось только время удерживания и одна палка в масс-спектре, довольно зыбкие доказательства, явно недостаточные для "вынесения приговора" (например, в допинговом контроле, контроле диоксинов и ксенбиотиков). А вот если использовать тандемную масс-спектрометрию и регистрировать один родительский и один (или несколько) дочерних ионов, то при их появлении можно однозначно говорить о детектировании целевого компонента, достигая практически такой же чувствительности и еще лучней селективности.

На самом деле, сегодняшний прогресс в протеомике во многом обязан тандемным системам LCQ, теперь и линейным квадрупольным ловушкам типа LTQ LX, а с другой стороны, огромная потребность этой быстро развивающейся отрасли науки стимулирует быстрые разработки новых приборов и методов анализа биомолекул. На сегодняшний день в этой области самым передовым и распространенным методом анализа стал 2DLC-ESI-MS/MS, то есть двумерная микроколоночная высокоэффективная жидкостная хроматография - ионизация в электроспрее - тандемная масс-спектрометрия, а самым распространенным прибором - LCQ (Advantage или DECA XP), которых в 2007 году сменил LCQ Fleet^®.

Ионно-циклотронный резонанс

Вернемся, однако, к другим типам масс-анализаторов. Благодаря, прежде всего, потребностям протеомики, метаболомики, липидомики и анализа биополимеров все более широкое распространение получил в последнее время масс-анализатор на основе ионно-циклоьтронного резонанса. Именно этот тип масс-анализатора позволяет наиболее точно померять массу иона, обладает очень высоким разрешением. Высокое разрешение позволяет работать с полипротонированными ионами, охотно образующимися при ионизации белков и пептидов в электроспрее, а высокая точность определения массы позволяет получать брутто-формулу ионов, делая возможным определять структуру последовательностей аминокислотных остатков в пептидах и белках, а также детектировать послетрансляционные модификации белков. Это сделало возможным секвенировать белки без их предварительного гидролиза на пептиды. Такой способ получил название "Top-down" протеомики.
Получение уникальной информации стало возможно благодаря применению масс-анализатора ионно-циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием. В этом анализаторе ионы влетают в сильное магнитное поле и вращаются там по циклическим орбитам (как в циклотроне, ускорителе элементарных частиц). Такой масс-анализатор обладает определенными преимуществами: имеет очень высокое разрешение, диапазон измеряемых масс весьма широк, может анализировать ионы, получаемые всеми способами. Однако, для своей работы он требует сильного магнитного поля, а значит, использования сильного магнита со сверхпроводящим соленойдом, поддерживаемым при очень низкой температуре (жидкого гелия, приблизительно - 270^оС). Примером такого масс-спектрометра является LTQ FT.
Дополнительные возможности открывает использование линейной квадрупольной ионной ловушки. В отличие от тороидальной ионной ловушки, как в FINNIGAN PolarisQ или FINNIGAN LCQ , ионы "ловятся" внутри квадруполя за счет запирающих потенциалов на входном и выходном концах. Затем, за счет резонансной радиочастоты выбрасываются в направлении перпендикулярном стержням квадруполя и регистрируются двумя электронными умножителями. Такой механизм осуществлен на приборе FINNIGAN LTQ и позволяет значительно увеличить популяцию захваченных ловушкой ионов, что ведет и к расширению динамического диапазона и к улучшению чувствительности. Именно этот прибор используется для "подготовки" ионов, вводимых в ячейку ионно-циклотронного резонанса в LTQ FT
Заинтересованные читатели могут запросить мультфильм, наглядно демонстрирующий процессы захвата, фрагментации и анализа ионов в линейной квадрупольной ионной ловушке.

Время-пролетный анализатор

При исследовании соединений, непереводимых в газовую фазу, также популярны "время-пролетные" (Time Of Flight, TOF) масс-анализаторы. Мы ранее говорили, что ионы сортируются по массам за счет закономерностей движения заряженных частиц в поле (магнитном или электростатическом). И это не совсем относится к время-пролетным анализаторам, поскольку в них, как раз, ионы движутся в бесполевом пространстве. Ионы из источника разгоняются электрическим полем, приобретая достаточно большую кинетическую энергию, и вылетают в бесполевое пространство. На входе в это пространство все ионы имеют одинаковую кинетическую энергию, а если вспомнить всем известную формулу, выражающую величину кинетической энергии через массу и скорость (E=mv²/2), то, очевидно, в зависимости от массы ионы будут двигаться с разными скоростями и, соотвественно, в разное время достигнут детектора, расположенного в конце трубы их пролета. Зарегистрировав их и измерив время, можно посчитать и их массу. Все процессы, о которых мы здесь говорим происходят за миллионные доли секунды. То есть, этот масс-анализатор очень "быстрый". На основе такого масс-анализатора можно построить очень быстрый (и чувствительный) масс-спектрометр, что может оказаться весьма выигрышным, особенно при анализе органических веществ, представляющих собой смесь огромного количества индивидуальных соединений (например, нефть). Примером такого прибора является GC/TOF MS TEMPUS.
Однако, раньше аналитики использовали другое преимущество этого метода - с этим анализатором гораздо проще получить очень широкий диапазон масс, то есть с его помощью легко измерять массы очень больших молекул. На базе квалрупольных анализаторов это сделать невозможно, недостаточно энергии для разгона больших молекул. Магнитные анализаторы такого масштаба окажутся слишком большими (рабочий диапазон масс магнитного анализатора пропорционален магнитному полю). Время-пролетные анализаторы оказались очень выигрышными для такого применения и могут использоваться для измерений масс огромных молекул (с массами в десятки и сотни тысяч атомных единиц). А наиболее подходящим методом ионизации оказался описанный выше MALDI (ионизация лазерной десорбцией при содействии матрицы). Дальнейшее развитие методов анализа показало, что той точности измерения массы, которую можно достичь на время-пролетных масс-анализаторах для больших масс явно недостаточно. В век протеомики никому не нужно знание массы белка с точностью +/- 500 Да. Поэтому основное развитие получили другие методы, работающее с белками, "разрезанными" на пептиды с помощью гидролиза трипсином (так называемая bottom-up протеомика), а их массы, как правило, не превышают 1500 - 2000 а.е.м. Времяпролетные масс-анализаторы, в основном, используются сегодня благодаря их простоте, скорости и относительно небольшой стоимости. Комбинации квадрупольных анализаторов с TOF или TOF-TOF также получили широкое распространение благодаря возможности точно измерять массы ионов (до 2 ppm).

Орбитальная ловушка ионов

В июне 2005 года представлен серийный масс-спектрометр, использующий новый масс-анализатор - орбитальную ловушку ионов. Этот масс-анализатор изобретен российским физиком Александром Макаровым, работающим в Thermo Fisher Scientific в Бремене/Германия.
Орбитальная ловушка ионов, или Orbitrap, не использует ни магнитных полей, как масс-спектрометр с двойной фокусировкой или ионно-циклотронного резонанса, ни радиочастот, как квадруполи или квадрупольные ионные ловушки. Новый масс-анализатор, базируется на электростатической аксиально-гармонической орбитальной ловушке ионов. Орбитальная ионная ловушка, использует симметричное статическое электрическое поле между внешним и внутренним электродами специальной формы. Попадающие в поле ионы начинают двигаться по стабильным циклическим траекториям вокруг центрального электрода и одновременно осцилировать вдоль оси центрального электрода (благодаря тому, что введенные перпендикулярно центральной оси в ловушку ионы обладают потенциальной энергией вследствие отклонения точки ввода от точки симметрии ловушки). Хотя радиальная и угловая частоты также зависят от m/z иона, гармоническая осциляция ионов вдоль оси z не зависит от этих частот. По аналогии с ионно-циклотронным резонансом ион детектируется по наведенному изображению тока на внешних электродах, частоты, соответствующие различным m/z, выделяются с помощью алгоритма Фурье-преобразования, а затем, конвертируются в масс-спектр.
Благодаря тому, что аксиальная осциляция не зависит от энергии ионов и тому, что электрическое поле установливается с высокой точностью и стабильностью, может быть достигнуто высокое разрешение и масса может быть измерена с высокой точностью. Орбитальная ловушка также характеризуется большей емкостью ионов. Большая емкость пространственного заряда по сравнению с ионно-циклотронной и квадрупольной ловушками позволяет достигать большей точности измерения массы, более широкого динамического диапазона и диапазона отношений величин массы к заряду. В течение первых же двух лет после появления этого масс-спектрометра он стал пользоваться большой популярностью во всем мире. Повышенный спрос на этот прибор обусловлен возможностью рутинного достижения разрешения порядка 100,000 на половине высоты пика, измерения точной массы иона, высокой чувствительности, быстроты и легкости работы, что востребовано в наиболее ответственных применениях масс-спектрометрии, таких как протеомика, метаболомика, разработка и анализ лекарственных средств, допинговый анализ у спортсменов и многих других. Кроме того, LTQ ORBITRAP^® представляет собой гибридный прибор. Ионы образуются в источнике атмосферной ионизации и попадают линейную квадрупольную ловушку LTQ XL, в которой они могут подвергнуты фрагментированию путем соударений (CID) и после этого введены в орбитальную ловушку, обеспечивающую высокое разрешение и точное измерение массы (лучше чем 2 ppm). Между линейной и орбитальной ловушками ионов имеется устройство C-Trap, в котором ионы формируются в плотный пакет для забрасывания в орибтальную ловушку. Для этого используется комбинация потенциалов и буфферный газ. Однако, в C-Trap также можно проводить контролируемую фрагментацию ионов и, поскольку здесь можно опрерировать с большими энергиями по сравнению с линейной квадрупольной ловушкой, фрагментация может быть более жесткой. Кроме того, можно "включить" еще один способ фрагментации - ETD (диссоциация ионов с переносом электронов). Все эти функции дают возможность получать информацию о строении исходной молекулы, что неизмеримо важно при анализе соединений сложного строения.
LTQ XL^®, входящий в состав гибридного прибора работоспособен как отдельный прибор. Более того, лаборатория купившая LTQ XL^® в последствии может дорастить его для гибридных приборов с Фурье-анализаторами орбитальная ловушка или ионно-циклотронный резонанс.
Подробнее об этом замечательном масс-спектрометре можно прочитать на следующих страницах: история создания орбитальной ловушки ионов, как устроен Orbitrap, аналитические и технические характеристики LTQ Orbitrap™, примеры аналитических применений.

Мы описали процессы получения ионов, рассортировки их массам (анализа по массам), теперь нам осталось их чем-нибудь измерить. Измеряя массу ионов (m/z) и их количество на каждой массе (интенсивность), мы и получим масс-спектр, который может, например, выглядеть как это показано на картинках.

Детектор

Итак, последним элементом описываемого нами упрощенного масс-спектрометра, является детектор заряженных частиц. Первые масс-спектрографы использовали в качестве детектора фотопластинку. Сейчас используются динодные вторично-электронные умножители, в которых ион, попадая на первый динод, выбивает из него пучок электронов, которые в свою очередь, попадая на следующий динод, выбивают из него еще большее количество электронов и т.д. Другой вариант - фотоумножители, регистрирующие свечение, возникающее при бомбардировке ионами люминофора. Кроме того, используются микроканальные умножители, системы типа диодных матриц и коллекторы, собирающие все ионы, попавшие в данную точку пространства (коллекторы Фарадея). Заинтересованный читатель может обратиться к подробностям детектирования ионов в специальной литературе, мы же не будем останавливаться на этом более подробно.

Продолжение...